Prinzip der Erweiterung des Parameterraums durch Lebensdauermultiplexing in der Durchflusszytometrie
Quelle: BAM, K. Hoffmann, FB 1.2
Die Durchflusszytometrie ist ein wertvolles Instrument in der Umwelt- und Lebensmittelmikrobiologie, der klinischen Diagnostik, im Hygienebereich und in der Grundlagenforschung. Immun-analytische Plattformen (Bead-basierte Immunoassays), die aus Durchflusszytometern und fluoreszenzkodierten Mikrobeads bestehen, ermöglichen den Einsatz von Hochdurchsatzverfahren und erlangen Bedeutung beispielsweise für die Bestimmung von Pharmazeutika, anthropogenen Markern oder Bakterien in Abwässern.
Dieser Artikel in Scientific Reports beschreibt ein alternatives Verfahren zu den üblicherweise verwendeten intensitätsbasierten Kodierungen für ein spektrales Multiplexing in der Durchflusszytometrie. Die Nutzung der Lumineszenzlebensdauer (LT) als zusätzlichen Kodierungsparameter kann die Anzahl der unterscheidbaren Analyte deutlich erhöhen. In enger Zusammenarbeit mit zwei kleinen und mittleren Unternehmen (KMU) wurde eine Plattform für ein Lebensdauer-Durchflusszytometer (LT-FCM) entwickelt, die eine Kombination aus einem unikalen Messinstrument und mikrometergroßen Polymerbeads mit Luminophoren mit unterschiedlicher Lebensdauerkodierung darstellt.
Während der Forschungs- und Entwicklungsarbeiten wurde unter anderem der Einfluss von Messparametern und Geräteeinstellungen wie Integrationszeitbereich und Breite des Messkanals sowie Messbedingungen (Photonenzahl, Signal-Hintergrund-Verhältnis) auf die Klassifizierung der LT-Codes untersucht. Das derzeitige Leistungsniveau des neu entwickelten, kompakten und kostengünstigen LT-FCM für das Auslesen von LT-Codes unter Verwendung einer einzelnen Anregungswellenlänge und eines einzelnen Detektionskanals beträgt fünf Codes auf der Basis von organischen und anorganischen Luminophoren.
Die Lebensdauerkodierung in der Durchflusszytometrie kann breitgefächerte Anwendungen finden, die von alternativen Anfärbestrategien für die Zellanalyse bis zur Verwendung von Fluoreszenzreportern reichen, deren Emissionseigenschaften entweder sensitiv gegenüber ihrer Mikroumgebung sind oder auf bioanalytische Bindungsereignisse mit einer Änderung ihrer Lumineszenzabklingkinetik reagieren. Ebenso sind markierungsfreie Techniken denkbar, die auf intrinsischen Lebensdauerunterschieden (Autofluoreszenz) basieren. Die LT-FCM in der Routineanalytik kann dazu beitragen, die Informationsdichte, beispielsweise von Bioassays zu erhöhen, um durch parallele und effiziente Detektion mehrere Analyte oder Zielstrukturen in einer einzigen Messung auszulesen.
Luminescence lifetime encoding in time-domain flow cytometry
Daniel Kage, Katrin Hoffmann, M. Wittkamp, J. Ameskamp, W. Göhde, Ute Resch-Genger
Scientific Reports, 2018
BAM Abteilung Analytische Chemie; Referenzmaterialien