01.11.2017
Links: Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie spezifisch fluorophormarkierter Hybridomzellen. Rechts: Die gleichen Hybridomzellen im Durchlicht.

Links: Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie spezifisch fluorophormarkierter Hybridomzellen. Überlagerung verschiedener Fluoreszenzkanäle; rot: lebende Hybridomzellen, die Oberflächen-IgG produzieren; grün: Zellen produzieren Antikörper, die selektiv für das Hapten sind. Rechts: Die gleichen Hybridomzellen im Durchlicht.

Quelle: BAM, Abteilung Analytische Chemie; Referenzmaterialien

Antikörper sind große Proteine (Eiweiße), die zur Abwehr von sogenannten Antigenen im Körper von Säugetieren in Rahmen einer polyklonalen Immunantwort gebildet werden. Aufgrund ihrer hohen Spezifität werden Antikörper gerne in hochselektiven (immun-)analytischen Methoden, in der medizinischen Diagnostik und in therapeutischen Anwendungen verwendet. Für diese Zwecke werden monoklonale Antikörper (mAk) bevorzugt, die von einer einzigen Zelllinie stammen und über die sogenannte Hybridomtechnik erzeugt werden. Das Screening von Hybridomzellen und die damit verbundenen Subklonierungen sind die kritischsten und zeitaufwändigsten Schritte bei der Produktion monoklonaler Antikörper und die Zahl der testbaren Zellen ist relativ begrenzt. Zur Entwicklung unserer antikörperbasierten Analysentechniken, besonders für kleine Moleküle (Haptene, auch inkomplette Antigene genannt) beschäftigen wir uns u. a. mit der Verbesserung und Beschleunigung von Methoden, die uns – und anderen Forschern – erlauben werden, einen direkteren Zugang zu Hybridomzellen zu erhalten, die die gewünschten hochselektiven monoklonalen Antikörper produzieren.

Ein Forscherteam an der BAM unter der Leitung von PD Dr. Rudolf Schneider entwickelte dafür eine gezielte Markierungsstrategie von Hybridomzellen in Kombination mit einer leistungsstarken Hochdurchsatzmethode, der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS), die eine haptenspezifische Isolierung von mAk-produzierenden Hybridomzellen erlaubt. Das zweistufige Vorgehen kombiniert das haptenspezifische Markieren der Zellen (mit einem Hapten-Peroxidase-Konjugat, welches anschließend mit einem fluorophor-gekoppelten Anti-Peroxidase-Antikörper sichtbar gemacht wird) mit dem Anfärben dieser Zellen mit einem farbstoffmarkierten Anti-Maus-IgG-Antikörper, der die Expression von membrangebundenen Antikörpern (vom Immunglobulin Typ G) anzeigt. Die markierten Zellen können leicht mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (s. Abbildung) unterschieden werden. Unter Anwendung der FACS-Technik in einem Durchflußzytometer können Hunderte von Hybridomzellen, die haptenspezifische mAbs produzieren, schnell und sicher aus einem Zell-Mix heraussortiert und als Einzelzellklone in Kavitäten von Mikrotiterplatten ausgesät werden.

Dieses neuartige Markierungsprotokoll, kombiniert mit einer Hochdurchsatz-Technik, liefert signifikante Fortschritte bei der Erzeugung von mAks, einschließlich höherer Ausbeute an Antikörper-produzierenden Hybridomzell-Klonen, garantierter Monoklonalität der sortierten Zellen und der Verkürzung der Entwicklungszeiten.

Hapten-Specific Single-Cell Selection of Hybridoma Clones by Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Generation of Monoclonal Antibodies
Martin Dippong, Peter Carl, C. Lenz, J. A. Schenk, Katrin Hoffmann, Timm Schwaar, Rudolf J. Schneider, Maren Kuhne
Analytical Chemistry, 2017, 2017, 89 (7), pp 4007–4012
BAM Abteilung Analytische Chemie; Referenzmaterialien